sábado, 9 de junio de 2012


UNIDAD 10 TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

 
Son todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo, amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas. Estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias y estan basadas en amplificación por PCR.


10.1 METODOS DE PURIFICACION Y ANALISIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS


OBTENCIÓN DE ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre.

El ADN en solución  es una mezcla de ADN mitocondrial, nuclear eucariota y viral/bacteriano si estuvieran presentes en la muestra virus/bacterias.

El sistema de valoración de la concentración de ADN será función de cuales han sido los tratamientos y, por tanto, del grado de pureza del ADN obtenido. Pueden emplearse desde métodos altamente sensibles y exactos como la espectrofotometría y fluorometría, hasta métodos aproximativos, tales como  la comparación  del grado de fluorescencia respecto a un control de concentración conocida.

Una vez conocida la concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el propósito de amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.



DETECCION DE FRAGMENTOS

1.      Separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o poliacrilamida. En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de características conocidas.

2.      Detección del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado colorimétrico o quimioluminiscente.


 TECNICAS DE DIAGNOSTICO DEL FRAGMENTO  AMPLIFICADO

1. Corte con enzimas de restricción: Los fragmentos generados en la restricción se separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados.

2. Hibridación:  Los fragmentos generados en el PCR se separan en  gel de agarosa, se transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se hibridan con un ADN sonda marcado.

     3.   Secuenciación: Los fragmentos generados durante la reacción de    secuenciación  se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida.


La electroforesis es una técnica habitual en el laboratorio clínico. Permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extraído de una muestra biológica sobre un soporte poroso (gel) y aplicamos un campo eléctrico, se producirá la migración diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz. La tinción del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molécula de ADN, y la exposición con luz ultravioleta, permite observar el resultado de ésta migración. El tamaño de los fragmentos de ADN se puede estimar comparándolos con el patrón de bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido. La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biológicas. Así por ejemplo se puede usar para comparar muestras de individuo sano frente a individuo enfermo, para la identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos o para la obtención de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel, puede ser extraído para análisis posteriores.






 
    SEP                               SENEPS                    DGEST


INSTITUTO TECNOLOGICO DE CD ALTAMIRANO









ALUMNA: Mariel Campos González.



N° de Control: 09930301




Lic. en Biología



Cd. Altamirano Gro.

 
 
OBJETIVO: Conoceremos y aplicaremos las bases moleculares del ADN para su manipulación y en el mejoramiento genético de especies de interés alimenticio, medico y ecológico.

martes, 5 de junio de 2012

TAREA 8
Como se realiza el control génico del "Gen BRCA"

BRCA1 y BRCA2 son genes humanos que pertenecen a una clase de genes conocidos como supresores de tumores.  La mutación de estos genes se ha relacionado con cáncer hereditario de seno y de ovario.
El riesgo de una mujer de desarrollar cáncer de mama y / o cáncer de ovario es mucho mayor si se hereda un nocivo (nocivo) mutación BRCA1 o BRCA2.  Los hombres con estas mutaciones tienen un mayor riesgo de cáncer de mama. Tanto hombres como mujeres que tienen mutaciones peligrosas BRCA1 o BRCA2 pueden estar en mayor riesgo de otros cánceres.

Si un gen BRCA1 o BRCA2 perjudiciales se encuentra, hay varias opciones disponibles para ayudar a una persona a manejar su riesgo de cáncer. 

Muchos estudios de investigación se están realizando para encontrar nuevas y mejores maneras de detectar, tratar y prevenir el cáncer en los genes BRCA1 y BRCA2 mutación transportistas.  Otros estudios se centran en la mejora de los métodos de asesoramiento genético y los resultados. Nuestro conocimiento en estas áreas está evolucionando rápidamente.




Tarea 9
¿LAS BACTERIAS DE DIFERENTES ESPECIES PUEDEN COMPARTIR PLASMIDOS?

Si, por que de acuerdo a las semejanzas de las bacterias pueden penetrar con mayor facilidad la pared celular de otra bacteria y asi compartir los plasmidos y material genetico. 

Los plásmidos pueden revolotear entre las bacterias de diferentes tipos  por lo general, deben estar en contacto y llevar a la resistencia múltiple, y asi poder entrar en ellas. Algunos plásmidos de bacterias compartir pequeños trozos de ADN, como el mini-cromosomas  que existen fuera de los cromosomas principales.

Ejemplo: La Haemophilus y la Neisseria.





9.2.2 QUIMICOS

Método del fosfato cálcico. Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos. En esta situación co-precipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución, etc.  
Método del DEAE dextrano. Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transientes. 
Método DNA desnudo. El DNA desnudo (técnica en fase altamente experiemtal) es incapaz de entrar en una célula y aún consiguiendo entrar en ellas es rápidamente degradado. La línea de investigación busca incorporar esas secuencias de DNA a un transportador, que le encierra y le lleva hasta la célula Diana en dónde a través de interacciones de membrana se asocia con ella para entregar el material al interior.
Los problemas que encontramos son que el DNA (rico en cargas -) por ser estructura polar  tiene muchas dificultades para cruzar la membrana plasmática. Además el DNA codificante para  1 gen es aproximadamente de 10 kb, esto representa la longitud aproximada de una célula, en el caso de encontrar el DNA sin ningun tipo de compactatción.
Método Péptidos fusiogénicos Los  péptidos fusiogénicos surgen en una linea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.
Estos péptidos fusiogénicosa se utilizan para compactar DNA. y de este modo adoptan DNA con proteínas ricas en cargas +, del tipos Histonas. Esto supone una condensación considerable, (visible con MET) ya que el DNA aparece en la forma de partículas de 50-150 nanometros, pero sólo un cierto grado de condensación permite que 1 transportador incluya 1 molécula de DNA. Asimismo la reducción de tamaño del DNA hasta unos 20 nanometros facilitaría el paso a la célula y hasta el núcleo, incrementando su protección contra las nucleases citoplasmáticas. En el proceso de penetración celular, los transportadores sintéticos (si su carga neta es +) interactuan con Aminoazucares de la Membrana plasmáticacon (carga -) para producir la incorporación a la célula en forma de endosomas. Por tanto tenemos un problema más a superar.





CONCLUSIONES:  En esta unidad nos enfocamos en lo que eran los mecanismos de transferencia, que estos nos explican como es que el ADN y los plasmidos son introducidos a las bacterias y en este caso existen la transduccion, transformacion, conjugacion y transfeccion. Al igual que existen varios tipos de mecanismos naturales y  artificiales; en los artificiales tenemos la microinyeccion, que este proceso se lleva a cabo en los animales, la electroporacion, se da en bacterias y la biobalistica que es exclusiva de plantas. En los mecanismos quimicos esta el metodo de fosfato de calcio que se lleva a cabo en el ADN desnudo, y distintos metodos.


9.1.5 TRANSFECCION

Es el proceso de transferencia genética desde una célula donadora a otra receptora mediatizado por partículas de bacteriófagos que contienen ADN genómico de la primera.
En la transducción podemos distinguir dos estapas diferenciadas:

1. Formación de la partícula fágica transductora: un trozo de material genético de la célula donadora se introduce en el interior de la cabeza de la cápsida de un fago. Las partículas transductoras son en cierta manera “subproductos” anómalos del ciclo normal del fago.
2. La partícula transductora inyecta de forma habitual el ADN que porta a la célula receptora, donde este ADN puede eventualmente recombinarse y expresar su información.
La transducción descubierta por Lederberg y Zinder se llama transducción generalizada.

  • Mediante ella se puede transferir cualquier marcador del genóforo del donador, con aproximadamente la misma frecuencia relativa (de ahí el calificativo de generalizada).

  • La transducción generalizada se produce sólo como consecuencia de infecciones líticas.
  •  
El ADN del genomio de la bacteria donadora que es introducido en la partícula transductora suele ir sin acompañamiento de ADN del propio fago. Por ello, a esta peculiar partícula consistente en cápsida del fago que encierra sólo ADN genofórico de la bacteria se la denomina pseudovirión.




9.2 MECANISMOS DE TRANSFERENCIA ARTIFICIAL

9.2.1 FISICOS

 Microinyección resulta ser una técnica muy potente y eficaz, ya que 1 de cada 5 células consigue incorporar el DNA foráneo de forma permanente. El problema de esta técnica es que exclusivamente se puede inyectar una célula cada vez, y por tanto no es el más recomendable para una terapia médica debido a que es demasiado laboriosa como para obtener un número de células indicadas (suficientes, aproximadamente un millar o más) para que el tratamiento tenga éxito.

Electroporación es una técnica que crea o que dota a la membrana de cierta permeabilidad al DNA durante unos pocos segundos debido a una descarga eléctrica. Si la célula o grupo de células sometidas, a dicho choque eléctrico están sumergidas en un medio rico en plásmidos, alguno de ellos puede penetrar en una célula. 
Una vez introducida la molécula de DNA recombinante en el interior de las células producirá su efecto permitiendo :
  • Seleccionar células que hayan incorporado el DNA. Este sería el caso del aislamiento de clones celulares que presentaran expresión de un determinado producto. Es posible por la incorporación en el propio vector de marcadores de selección, típicamente la resistencia de G418 (neomicina)
  • A las pocas horas o dias detectar la presencia de la proteína codificada por el plásmido.
Biobalistica: es una técnica basada en principios físicos que permite literalmente disparar genes a las plantas. Para ello, el ácido nucleico que codifica los genes de interés se deposita en minúsculas partículas de oro u tungsteno, las que posteriormente son impulsadas por una fuerte columna de un gas (generalmente helio), hasta impactar los tejidos blanco de la especie a transformar. De esta manera, al penetrar las micropartículas la célula blanco, estas alcanzan el núcleo y depositan el ADN que portan transformando la célula con un nuevo gen.



lunes, 4 de junio de 2012

9.1.4 RECOMBINACION

La recombinación en virus se descubrió por Delbrück, Bailey y Hershey en 1946. Este hallazgo fue posible a la existencia de variabilidad originada por mutación en caracteres de los virus fácilmente observables en los medios de cultivo. Dentro de este tipo de mutaciones están los caracteres de placa, el rango de hospedador, la sensibilidad a la temperatura, etc. Entre los caracteres de placa que se pueden analizar están la morfología de las calvas o halos de lisis que producen los virus al matar a las bacterias de cultivo en césped.
La ausencia de turbidez se debe a que el virus ha matado a los dos tipos de cepas bacterianas la B y la B/2, mientras que la presencia de turbidez se debe a que el virus a matado solamente a la cepa B pero no a la cepa B/2.

En el siguiente esquema se indican los diferentes tipos de virus descendientes y los tipos de calvas o halos de lisis detectados.


Cuando se lleva a cabo la infección mixta anterior, aparecen virus descendientes de tipo parental (dobles mutantes y normales) y virus descendientes de tipo recombinante (r+h- y r-h+). Cada vez que se da un entrecruzamiento entre los loci analizados aparece un virus recombinante r+h- y otro virus r-h+. De forma que el número de virus descendientes r+h- debe ser aproximadamente igual que el de virus r-h+. Lo mismo sucede con los virus de tipo parental, se espera que existan aproximadamente igual cantidad de descendientes r+h+ que de virus r-h-.
Cuanto más lejos estén dos loci en el genoma viral o ADN del virus más probable es que se de un entrecruzamiento entre ambos y la frecuencia de recombinación (Fr) será mayor. Cuanto más cerca estén dos genes menor será la probabilidad de entrecruzamiento y menor será la frecuencia de recombinación.
La forma de estimar la frecuencia de recombinación es, por consiguiente, semejante a la manera empleada en eucariontes. La frecuencia de recombinación es igual a la frecuencia con la que aparecen virus recombinantes en los descendientes multiplicada por cien.
Fr = (Recombinantes/Total) x 100


Para crear una bacteria recombinante se incorpora el ADN al interior de la bacteria, mediante determinadas condiciones de laboratorio, de forma que ésta pueda fabricar la información genética contenida en el ADN insertado.

 




9.1.2 CONJUGACION

En este proceso, una bacteria donadora F+ transmite a través de un puente o pili, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora F-. La bacteria que se llama F+ posee un plasmido, además del cromosoma bacteriano.

El intercambio de material genético necesita de un contacto entre la bacteria dadora y la bacteria receptora. La cualidad de dador está unida a un factor de fertilidad (F) que puede ser perdido. La transferencia cromosómica se realiza generalmente con baja frecuencia. No obstante, en las poblaciones F+, existen mutantes capaces de transferir los genes cromosómicos a muy alta frecuencia.
La duración del contacto entre bacteria dadora y bacteria receptora condiciona la importancia del fragmento cromosómico transmitido. El estudio de la conjugación ha permitido establecer los mapas cromosómicos de ciertas bacterias. Ciertamente, la conjugación juega un papel en la aparición en las bacterias de resistencia a los antibióticos.



9.1.3 TRANSDUCCION

En este caso la transferencia de ADN de una bacteria a otra se realiza a través de un virus bacteriófago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias.
a) el virus se acopla a la bacteria
b) el virus rompe la pared bacteriana
c) el virus inyecta su ADN

TRANSDUCCIÓN GENERALIZADA
Se caracteriza porque en ella se puede transferir cualquier trozo de genóforo bacteriano, con tal de que tenga un tamaño compatible con la capacidad de “empaquetado” de ADN de la cápsida del fago. La partícula transductora (pseudovirión) se forma por empaquetamiento anómalo de ADN genofórico bacteriano. En el interior de la cabeza del pseudovirión sólo existe ADN bacteriano, sin ADN del fago. Las partículas transductoras sólo se forman como consecuencia de infecciones líticas del fago.