domingo, 10 de junio de 2012
sábado, 9 de junio de 2012
UNIDAD 10 TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
Son todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo, amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas. Estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias y estan basadas en amplificación por PCR.
10.1 METODOS DE PURIFICACION Y ANALISIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de
ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima
muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas
del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de
muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la
sangre.
OBTENCIÓN
DE ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de
ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima
muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas
del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de
muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la
sangre.
El ADN
en solución es una mezcla de ADN
mitocondrial, nuclear eucariota y viral/bacteriano si estuvieran presentes en
la muestra virus/bacterias.
1.
Separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o
poliacrilamida. En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación
de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de
características conocidas.
El sistema de valoración de la concentración de ADN será
función de cuales han sido los tratamientos y, por tanto, del grado de pureza
del ADN obtenido. Pueden emplearse desde métodos altamente sensibles y exactos
como la espectrofotometría y fluorometría, hasta métodos aproximativos, tales
como la comparación del grado de fluorescencia respecto a un
control de concentración conocida.
Una vez conocida la
concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el propósito de
amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.
DETECCION DE FRAGMENTOS
1.
Separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o
poliacrilamida. En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación
de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de
características conocidas.
2.
Detección del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado colorimétrico o
quimioluminiscente.
1.
Corte con enzimas de restricción: Los fragmentos generados en la restricción se
separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados.
2. Hibridación: Los fragmentos generados en
el PCR se separan en gel de agarosa, se
transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se
hibridan con un ADN sonda marcado.
La electroforesis es una técnica habitual en el laboratorio clínico. Permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extraído de una muestra biológica sobre un soporte poroso (gel) y aplicamos un campo eléctrico, se producirá la migración diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz. La tinción del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molécula de ADN, y la exposición con luz ultravioleta, permite observar el resultado de ésta migración. El tamaño de los fragmentos de ADN se puede estimar comparándolos con el patrón de bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido. La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biológicas. Así por ejemplo se puede usar para comparar muestras de individuo sano frente a individuo enfermo, para la identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos o para la obtención de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel, puede ser extraído para análisis posteriores.
SEP
SENEPS
DGEST
INSTITUTO
TECNOLOGICO DE CD ALTAMIRANO
ALUMNA:
Mariel Campos González.
N° de Control:
09930301
Lic.
en Biología
Cd. Altamirano
Gro.
OBJETIVO: Conoceremos y aplicaremos
las bases
moleculares del ADN
para su manipulación
y en el mejoramiento
genético de especies
de interés alimenticio,
medico y ecológico.
martes, 5 de junio de 2012
TAREA 8
Como se realiza el control génico del "Gen BRCA"
BRCA1 y BRCA2 son genes humanos que pertenecen a una clase de genes conocidos como supresores de tumores. La mutación de estos genes se ha relacionado con cáncer hereditario de seno y de ovario.
El riesgo de una mujer de desarrollar cáncer de mama y / o cáncer de ovario es mucho mayor si se hereda un nocivo (nocivo) mutación BRCA1 o BRCA2. Los hombres con estas mutaciones tienen un mayor riesgo de cáncer de mama. Tanto hombres como mujeres que tienen mutaciones peligrosas BRCA1 o BRCA2 pueden estar en mayor riesgo de otros cánceres.
Si un gen BRCA1 o BRCA2 perjudiciales se encuentra, hay varias opciones disponibles para ayudar a una persona a manejar su riesgo de cáncer.
Muchos estudios de investigación se están realizando para encontrar nuevas y mejores maneras de detectar, tratar y prevenir el cáncer en los genes BRCA1 y BRCA2 mutación transportistas. Otros estudios se centran en la mejora de los métodos de asesoramiento genético y los resultados. Nuestro conocimiento en estas áreas está evolucionando rápidamente.
Tarea 9
¿LAS BACTERIAS DE DIFERENTES ESPECIES PUEDEN COMPARTIR PLASMIDOS?
Si, por que de acuerdo a las semejanzas de las bacterias pueden penetrar con mayor facilidad la pared celular de otra bacteria y asi compartir los plasmidos y material genetico.
Los plásmidos pueden revolotear entre las bacterias de diferentes tipos por lo general, deben estar en contacto y llevar a la resistencia múltiple, y asi poder entrar en ellas. Algunos plásmidos de bacterias compartir pequeños trozos de ADN, como el mini-cromosomas que existen fuera de los cromosomas principales.
Ejemplo: La Haemophilus y la Neisseria.
9.2.2 QUIMICOS
Método del fosfato cálcico. Basado en la
obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución
salina de fosfatos. En esta situación co-precipitan formando unos agregados que
son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con
calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño
y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve
afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución,
etc.
Método del DEAE
dextrano. Basado en la obtención de complejos entre la
resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una
carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA.
El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico
mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones
transientes.
Método DNA desnudo. El DNA desnudo (técnica en fase altamente experiemtal) es incapaz de
entrar en una célula y aún consiguiendo entrar en ellas es rápidamente
degradado. La línea de investigación busca incorporar esas secuencias de DNA a
un transportador, que le encierra y le lleva hasta la célula Diana en dónde a
través de interacciones de membrana se asocia con ella para entregar el
material al interior.
Los problemas que encontramos son que el DNA (rico en cargas -) por ser estructura polar tiene muchas dificultades para cruzar la membrana plasmática. Además el DNA codificante para 1 gen es aproximadamente de 10 kb, esto representa la longitud aproximada de una célula, en el caso de encontrar el DNA sin ningun tipo de compactatción.
Los problemas que encontramos son que el DNA (rico en cargas -) por ser estructura polar tiene muchas dificultades para cruzar la membrana plasmática. Además el DNA codificante para 1 gen es aproximadamente de 10 kb, esto representa la longitud aproximada de una célula, en el caso de encontrar el DNA sin ningun tipo de compactatción.
Método Péptidos
fusiogénicos Los
péptidos fusiogénicos surgen en una linea de trabajo que nos permita paliar
aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.
Estos
péptidos fusiogénicosa se utilizan para compactar DNA. y de este modo adoptan
DNA con proteínas ricas en cargas +, del tipos Histonas. Esto supone una
condensación considerable, (visible con MET) ya que el DNA aparece en la forma
de partículas de 50-150 nanometros, pero sólo un cierto grado de condensación
permite que 1 transportador incluya 1 molécula de DNA. Asimismo la reducción de
tamaño del DNA hasta unos 20 nanometros facilitaría el paso a la célula y hasta
el núcleo, incrementando su protección contra las nucleases citoplasmáticas. En
el proceso de penetración celular, los transportadores sintéticos (si su carga
neta es +) interactuan con Aminoazucares de la Membrana plasmáticacon (carga -)
para producir la incorporación a la célula en forma de endosomas. Por tanto
tenemos un problema más a superar.
CONCLUSIONES: En esta unidad nos enfocamos en lo que eran los mecanismos de transferencia, que estos nos explican como es que el ADN y los plasmidos son introducidos a las bacterias y en este caso existen la transduccion, transformacion, conjugacion y transfeccion. Al igual que existen varios tipos de mecanismos naturales y artificiales; en los artificiales tenemos la microinyeccion, que este proceso se lleva a cabo en los animales, la electroporacion, se da en bacterias y la biobalistica que es exclusiva de plantas. En los mecanismos quimicos esta el metodo de fosfato de calcio que se lleva a cabo en el ADN desnudo, y distintos metodos.
9.1.5 TRANSFECCION
Es el proceso de transferencia genética desde una célula donadora a otra receptora
mediatizado por partículas de bacteriófagos que contienen ADN genómico de la
primera.
En la transducción podemos distinguir dos estapas diferenciadas:
1. Formación de la
partícula fágica transductora: un trozo de
material genético de la célula donadora se introduce en el interior de la cabeza
de la cápsida de un fago. Las partículas transductoras son en cierta manera
“subproductos” anómalos del ciclo normal del fago.
2. La partícula transductora
inyecta de forma habitual el ADN que porta a la célula receptora, donde este ADN
puede eventualmente recombinarse y
expresar su información.
La transducción descubierta por Lederberg y
Zinder se llama transducción
generalizada.
| |
| |
El ADN del genomio de la bacteria donadora
que es introducido en la partícula transductora suele ir sin acompañamiento de ADN del propio
fago. Por ello, a esta peculiar partícula consistente en cápsida del fago
que encierra sólo ADN genofórico de la bacteria se la denomina pseudovirión.
9.2 MECANISMOS DE TRANSFERENCIA ARTIFICIAL
9.2.1 FISICOS
Electroporación es
una técnica que crea o que dota a la membrana de cierta permeabilidad al DNA
durante unos pocos segundos debido a una descarga eléctrica. Si la célula o
grupo de células sometidas, a dicho choque eléctrico están sumergidas en un
medio rico en plásmidos, alguno de ellos puede penetrar en una célula.
Una vez introducida la molécula
de DNA recombinante en el interior de las células producirá su efecto
permitiendo :
 |
lunes, 4 de junio de 2012
9.1.4 RECOMBINACION
La recombinación en virus se descubrió por
Delbrück, Bailey y Hershey en 1946. Este hallazgo fue posible a la existencia de
variabilidad originada por mutación en caracteres de los virus fácilmente
observables en los medios de cultivo. Dentro de este tipo de mutaciones están
los caracteres de placa, el rango de hospedador, la sensibilidad a la
temperatura, etc. Entre los caracteres de placa que se pueden analizar están
la morfología de las calvas o halos de lisis que producen los virus al matar a
las bacterias de cultivo en césped.
La ausencia de turbidez se debe a que el virus
ha matado a los dos tipos de cepas bacterianas la B y la B/2, mientras que la
presencia de turbidez se debe a que el virus a matado solamente a la cepa B pero
no a la cepa B/2.
En el siguiente esquema se indican los
diferentes tipos de virus descendientes y los tipos de calvas o halos de lisis
detectados.
Cuando se lleva a cabo la infección mixta
anterior, aparecen virus descendientes de tipo parental (dobles mutantes y
normales) y virus descendientes de tipo recombinante (r+h- y r-h+). Cada vez que
se da un entrecruzamiento entre los loci analizados aparece un virus
recombinante r+h- y otro virus r-h+. De forma que el número de virus
descendientes r+h- debe ser aproximadamente igual que el de virus r-h+. Lo mismo
sucede con los virus de tipo parental, se espera que existan aproximadamente
igual cantidad de descendientes r+h+ que de virus r-h-.
Cuanto más lejos estén dos loci en el genoma
viral o ADN del virus más probable es que se de un entrecruzamiento entre ambos
y la frecuencia de recombinación (Fr) será mayor. Cuanto más cerca estén dos
genes menor será la probabilidad de entrecruzamiento y menor será la frecuencia
de recombinación.
La forma de estimar la frecuencia de
recombinación es, por consiguiente, semejante a la manera empleada en
eucariontes. La frecuencia de recombinación es igual a la frecuencia con la que
aparecen virus recombinantes en los descendientes multiplicada por
cien.
Fr = (Recombinantes/Total) x 100
Para
crear una bacteria recombinante se incorpora el ADN al interior de la bacteria,
mediante determinadas condiciones de laboratorio, de forma que ésta pueda
fabricar la información genética contenida en el ADN insertado.
9.1.2 CONJUGACION
En este proceso, una bacteria donadora F+ transmite a través de un puente o pili, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora F-. La bacteria que se llama F+ posee un plasmido, además del cromosoma bacteriano.
El intercambio de material genético
necesita de un contacto entre la bacteria dadora y la bacteria receptora. La
cualidad de dador está unida a un factor de
fertilidad (F) que puede ser perdido. La transferencia cromosómica se realiza generalmente con baja frecuencia. No obstante,
en las poblaciones F+, existen mutantes capaces de transferir los genes cromosómicos a muy alta frecuencia.
La duración
del contacto entre bacteria dadora y bacteria receptora condiciona la
importancia del fragmento cromosómico transmitido.
El estudio de la conjugación ha permitido
establecer los mapas cromosómicos de ciertas
bacterias. Ciertamente, la conjugación juega un
papel en la aparición en las bacterias de
resistencia a los antibióticos.
9.1.3 TRANSDUCCION
En este caso la transferencia de ADN de una bacteria a otra se realiza a través de un virus bacteriófago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias.
b) el virus rompe la pared bacteriana
c) el virus inyecta su ADN
Se caracteriza porque en ella se puede
transferir cualquier trozo de genóforo bacteriano, con tal de que tenga
un tamaño compatible con la capacidad de “empaquetado” de ADN de la cápsida del
fago. La partícula transductora (pseudovirión) se forma por empaquetamiento
anómalo de ADN genofórico bacteriano. En el interior de la cabeza del
pseudovirión sólo existe ADN bacteriano, sin ADN del fago. Las
partículas transductoras sólo se forman como consecuencia de infecciones
líticas del fago.
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