UNIDAD 10 TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
Son todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo, amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas. Estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias y estan basadas en amplificación por PCR.
10.1 METODOS DE PURIFICACION Y ANALISIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de
ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima
muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas
del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de
muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la
sangre.
OBTENCIÓN
DE ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de
ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima
muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas
del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de
muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la
sangre.
El ADN
en solución es una mezcla de ADN
mitocondrial, nuclear eucariota y viral/bacteriano si estuvieran presentes en
la muestra virus/bacterias.
1.
Separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o
poliacrilamida. En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación
de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de
características conocidas.
El sistema de valoración de la concentración de ADN será
función de cuales han sido los tratamientos y, por tanto, del grado de pureza
del ADN obtenido. Pueden emplearse desde métodos altamente sensibles y exactos
como la espectrofotometría y fluorometría, hasta métodos aproximativos, tales
como la comparación del grado de fluorescencia respecto a un
control de concentración conocida.
Una vez conocida la
concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el propósito de
amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.
DETECCION DE FRAGMENTOS
1.
Separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o
poliacrilamida. En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación
de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de
características conocidas.
2.
Detección del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado colorimétrico o
quimioluminiscente.
1.
Corte con enzimas de restricción: Los fragmentos generados en la restricción se
separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados.
2. Hibridación: Los fragmentos generados en
el PCR se separan en gel de agarosa, se
transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se
hibridan con un ADN sonda marcado.
La electroforesis es una técnica habitual en el laboratorio clínico. Permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extraído de una muestra biológica sobre un soporte poroso (gel) y aplicamos un campo eléctrico, se producirá la migración diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz. La tinción del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molécula de ADN, y la exposición con luz ultravioleta, permite observar el resultado de ésta migración. El tamaño de los fragmentos de ADN se puede estimar comparándolos con el patrón de bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido. La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biológicas. Así por ejemplo se puede usar para comparar muestras de individuo sano frente a individuo enfermo, para la identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos o para la obtención de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel, puede ser extraído para análisis posteriores.
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