PRACTICA : EXTRACCION Y SEPARACION DE DNA

ANTECEDENTES:

Además del agua, los carbohidratos, las proteinas y los lipidos, los seres vivos estan constituidos por otras moleculas que, aunque en menor cantidad, desempeñan funciones muy importantes. Los acidos nucleicos (DNA Y RNA) son biomoleculas solubles en agua que desempeñan funciones diversas, son moleculas complejas producidas por las celulas vivas; son esenciales para todos los organismos vivos. Estas moleculas gobiernan el desarrollo del cuerpo y sus caracteristicas especificas, ya que proporcionan la informacion hereditaria y ponen en funcionamiento la produccion de proteinas.

OBJETIVO:

Extraer el DNA y RNA de tejidos animales o vegetales e identificarlos como tales.

MATERIAL:

• Tubos de centrifuga
• Tubos de ensayo de 5ml
• Centrifuga
• Micropipetas de 1000 y 200 ul
• Agua destilada esteril (20 ml para todos)
• Etanol al 100% frio 20 ml
• NaCl 3M
• Buffer de extraccion de ADN (Urea, NaCl, EDTA, 20 ml)
• Fenol/cloroformo/isopropanol frio 20 ml.
• Mortero y pistilo
• Higado de res
• Papel aluminio
• Cleenpack
• Guantes

PROCEDIMIENTO:

A) Rompimiento de membranas y paredes celulares

Toma una muestra  del tejido de higado (5 gr. aproximadamente) y muelelo con el mortero.

B) Digestion

Coloca tu muestra molida (1 gr aprox.) en un tubo de eppendorf de 1 ml y agregale el Buffer de extraccion (tris-HCl 0.05 M, Urea 7 M) a tempeatura de cuarto (500 ul aprox.)

Cuando hayas agregado el Buffer de extraccion a tu muestra, agitale e incubala por 10 minutos con agitacion esporádica.

C)

A la mezcla que tienes en tu tubo de ensayo agregale 500 ul. de Fenol/Cloroformo/isopropanol frio sa guantes y no inhales los vapores.

Agita vigorosamente en Vortex, cuidando que no se tire el contenido del tubo, deja reposar a temperatura ambiente por 5 minutos.

Extrae la fase acuosa (500 ul aprox.) con una micropipeta, si no se separan las fases centrifuga a 10 000 rpm por 10 minutos y con una temperatura de 6°c.

Extrae la fase acuosa superior  una vez centrifugada.

D)

Precipitacion de acidos nucleicos DNA Y RNA

A la fase acuosa que extraes (500 ul), colócala en un tubo eppendorf limpio y agregale 400 ul. de etanol (100%) frio y 75 ul de NaCl 3 M. mezcla por inversion, suave y observa como se precipita el DNA.

D) Recuperacion de la pastilla.

Centrifuga tu tubo por 2 minutos a 10 000 rpm, recoge la pastilla del fondo del tubo

E) Resuspension

Resuspension de la pastilla de DNA en 5 ml de agua destilada esteril.

 CUESTIONARIO:

4.4  Replicación

in vitro del ADN (PCR)

La replicacion  in vitro del ADN (PCR) es la amplificación de DNA in vitro por medio de la polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador.

El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA.

Se realiza la amplificación de un segmento específico de DNA, teniendo poco material disponible.

La reaccion en cadena polimerasa fue diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1987. Ganó el premio Nóbel de Química en 1993 por su invento.

Utilizo el PCR para amplificación del gen de b-hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.

• A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar.
• El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis.
• Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.
• Sus aplicaciones son múltiples:  medicina forense, diagnósticos, análisis prenatales, etc.

Materiales para PCR:

• Termociclador “Thermo cycler”
• Microcentrífuga
• Micropipetas de 2, 20 y 200 ul
• Microtubos para “PCR”, estériles
• Puntas estériles
• Agua destilada, desionizada y estéril

• ADN molde (ADN en estudio)
• Primer Forward y Reverse
• dNTP’s (dATP, dTTP, dCTP, dGTP de    [25 μM] c/u)
• 10X buffer para PCR (Solución amortiguadora para  “PCR”)
• MgCl2  (25 mM)
• BSA
• Polimerasa Taq

       La PCR se realiza en un Termociclador y es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.

 

 

 

CONCLUSION:

En esta unidad vimos como es que la cadena del ADN se replica y las enzimas que le ayudan a llevar a cabo este desarrollo, en la imagenes fuimos viendo estos pasos y tambien como es que este metodo se puede llevar a cabo por medio de otras tecnicas como son la PCR.

 

 

laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/pcr.html

es.wikipedia.org/wiki/Replicación_de_ADN

biolmol.fcien.edu.uy/materiales/Replicacion_del_ADN.pdf

www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htm

 

 

 

4.3 Control genético de la replicación.

El proceso resultante de la duplicación de ADN se conoce como división celular, la cual se ha

estudiado a nivel citológico estableciéndose ciertas pautas cubiertas por lo que se conoce como ciclo celular.

La mayor parte de los estudios de ciclo celular se han llevado a cabo empleando S. cerevisiae, la levadura del pan y la cerveza también conocida como la levadura de gemación por su característico estilo de división. En el caso de este organismo hay que añadir la ventaja de que actualmente se conocen los aproximadamente 16 millones de pares de nucleótidos que constituyen la secuencia completa de su genoma.

Los fundamentos de nuestro conocimiento actual del ciclo celular en levaduras vienen de la búsqueda sistemática de mutaciones en genes que codifican para componentes de la maquinaria del ciclo.

Estos estudios han permitido identificar una familia de proteínas quinasas dependientes de ciclina, -Cyclin Dependent Kinases, Cdk- que incluyen a Cdc28 de S. cerevisiae, y a su homólogo en S. pombe cdc2, y que juegan un papel central en los procesos claves del ciclo celular: la entrada en ciclo, la síntesis de ADN y la regulación de la mitosis. Estas quinasas son las subunidades catalíticas de un complejo que incluye también na subunidad reguladora, denominada ciclina, necesaria para la función del complejo al determinar la localización o la especificidad de sustrato de la quinasa.

En los últimos años se han encontrado también homólogos a estas quinasas en todos los eucariotas en los que se han buscado, y que incluyen desde el gusano nematodo Caenorhabditis elegans, a la mosca Drosophila melanogaster , a mamíferos como el ratón y el hombre y plantas como Arabidopsis thaliana, indicando que el sistema de control del ciclo celular es general en todos los eucariotas y validando a las levaduras como modelos de estudio.

4.2. Replicación del DNA en eucariontes.

En la célula eucariótica el proceso de replicación del ADN no empieza por los extremos de la molécula sino que parte de varios puntos a la vez y progresa en ambas direcciones formando los llamados ojos de replicación. Primero se separan las dos cadenas de nucleótidos y, una vez separadas, van entrando los nucleótidostrifosfato complementarios de cada uno de los de las cadenas del ADN. Las enzimas ADN polimerasas los unen entre sí formando dos nuevas cadenas complementarias de cada una de las cadenas del ADN original. Se dice que la síntesis de ADN es semiconservativa porque cada una de las cadenas "hijas" está formada por una de las cadenas del ADN original y una nueva cadena.

La replicación del ADN en el ser humano a una velocidad de 50 nucleótidos por segundo, en procariotas a 500/segundo. Los nucleótidos tienen que se armados y estar disponibles en el núcleo conjuntamente con la energía para unirlos.

La iniciación de la replicación siempre acontece en un cierto grupo de nucleótidos, el origen de la replicación, requiere entre otras de las enzimas helicasas para romper los puentes hidrógeno y las topoisomerasas para aliviar la tensión y de las proteínas de unión a cadena simple para mantener separadas las cadenas abiertas.

Una vez que se abre la molécula, se forma una área conocida como "burbuja de replicación" en ella se encuentran las "horquillas de replicación" . Por acción de la la ADN polimerasa los nuevos nucleótidos entran en la horquilla y se enlazan con el nucleótido correspondiente de la cadena de origen (A con T, C con G). Los procariotas abren una sola burbuja de replicación, mientras que los eucariotas múltiples. El ADN se replica en toda su longitud por confluencia de las "burbujas".

Dado que las cadenas del ADN son antiparalelas, y que la replicación procede solo en la dirección 5' to 3' en ambas cadenas, numerosos experimentos mostraron que, una cadena formará una copia continua, mientras que en la otra se formarán una serie de fragmentos cortos conocidos como fragmentos de Okazaki . La cadena que se sintetiza de manera continua se conoce como cadena adelantada y, la que se sintetiza en fragmentos, cadena atrasada.

Para que trabaje la ADN polimerasa es necesario la presencia, en el inicio de cada nuevo fragmento, de pequeñas unidades de ARN conocidas como cebadores, a posteriori, cuando la polimerasa toca el extremo 5' de un cebador, se activan otras enzimas, que remueven los fragmentos de ARN, colocan nucleótidos de ADN en su lugar y, una ADN ligasa los une a la cadena en crecimiento.

4.1 Replicación del genoma procariótico

En el punto de origen u ORI, que es un lugar del cromosoma con gran contenido de A y T, la doble hélice se abre, mediante la DNA helicasa y las proteínas desestabilizadoras de la hélice o proteínas de unión a DNA de una sola cadena, vuelven recta la cromatina y la mantienen abierta. La DNA polimerasa sintetiza las cadenas complementarias a cada una de las cadenas primitivas. Forma dos copias activas de ADN, una es continua, o sea, basta con agregar los nucleotidos correspondientes porque la hebra antigua tiene 3', por lo que se crea una 5´. En la otra hebra, se produce un proceso discontinuo, debido a que la hebra quedo con un final 5', debiendo partir con un 3', y la célula es incapaz de seguir la cadena con este final, para que se inicie la copia del DNA hace falta un corto RNA específico (10 pares de bases), denominado RNA cebador, que hace que empiece a actuar la DNA polimerasa. El RNA cebador es generado por la RNA primasa (sintetizadora de RNA). Esta enzima se une directamente a la DNA helicasa, formando un complejo llamada primosoma, que se va desplazando con la cadena en formación. Conforme van existiendo fragmentos de cadena abiertos de suficiente longitud, se va sintetizando la cadena discontinua formando pequeños fragmentos, denominados Fragmentos de Okazaki, cada uno de unos 1000 nucleótidos. . Hace falta un RNA cebador por cada fragmento de Okazaki. La RNA primasa, va sintezando a intervalos los RNA cebadores que van siendo incorporados a la copia como si fueran ADN, entre los fragmentos de Okazaki, hasta que se alcanza el RNA cebador del fragmento de Okazaki ya terminado. La cadena con ARN cebador, es denominada cadena retrasada .

El DNA sintetizado en la cadena retrasada y su cadena patrón sufren un plegamiento, de tal forma que la DNA polimerasa de la cadena conductora se unen para formar un complejo único, de modo que las proteínas de replicación puedan utilizarse conjuntamente en la replicación de ambas cadenas. Las topoisomerasas mantienen esta estructura y evitan que el DNA se enrede por superenrrollamiento, cortando un enlace fosfodiester, y a esto se le llama nick.Además, existe una proteína llamada SSB, que estabiliza la forma monocatenaria de la hebra en replicación, para que no se acople por complementariedad de bases con ella misma.

Exiten tres tipos de ADN-polimerasa, la I, es la encarga de reparar la hebra; la II, de ayudar a la III; y la III, agrega las bases a la hebra.

La labor de la ADN-pol I es exonucleasa, puede poner bases como sacar bases, con esto puede reparar la hebra. El dominio de esta proteína encargado de incluir bases a la hebra se llama Fragmento Klenow, que puede ser liberado del resto de la proteína por la Tripsina.

La replicación del ADN produce una copia de sí mismo por medio de enzimas que además de ser muy exactas poseen un sistema de reparación de errores. El mecanismo de replicación es es esencialmente el mismo en todas las células. Es un proceso semiconservativo porque cada uno de los dos ADN hijos tiene una cadena del ADN anterior.

Hay 1 lugar de origen de replicación que se muestra en la horquilla de replicación (replication fork) y que señala el avance de la copia. La horquilla (fork) indica que se está haciendo la separación y la replicación a la vez. El avance es bidireccional, lo que acorta el tiempo. En el sitio en que empieza la replicación se organizan las proteínas en un complejo llamado replisma. La replicación del ADN en procariotas sucede a una velocidad de 500 nucleótidos por segundo.

La  DNA polimerasa I de E. coli es una sola cadena polipeptídica de Mr 109 000. Contiene un átomo de zinc por molécula. Cataliza la polimerización en el sentido 5´         3´.

Todas las polimerasas de procariotes muestran actividad exonucleasa, es decir pueden hidrolizar DNA, en procariontes pueden hidrolizar DNA de cadena sencilla (en la dirección 3´      5´) y de cadena doble (en la dirección 5´         3´).

LA DNA polimerasa III de E. coli esta formada por 7 subunidades: a, b, g, d, e, q y t. Las siete son escenciales para la actividad máxima.

La DNA pol. III es la principal enzima de replicación en E. coli. La DNA pol. I es responsable de la reparación de DNA dañado. La funcion de la DNA pol II no esta todavía clara.

SEP                        SNEST                  DGEST

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

 

ALUMNA: Mariel Campos González.

N° de Control: 09930301

Lic. en Biología

Cd. Altamirano Gro.

EXPERIMENTO DE MESESLSON Y STAHL

Meselson y Stahl (1957) diseñaron un experimento para tratar de averiguar la forma en la que se realiza la replicación del ADN en E. coli. diseñaron un experimento donde hicieron crecer células de Escherichia coli en presencia de Nitrógeno-15, un isótopo del nitrógeno más pesado de lo habitual (Nitrógeno-14). En consecuencia, el isótopo se adhirió a las cadenas de ADN, haciéndolas más pesadas.

Una vez conseguido el primer objetivo, las células fueron transferidas a un medio que contenía Nitrógeno-14, es decir, un medio más ligero, y se les dejó replicarse. El ADN fue extraído para hacer una centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, en donde hay más densidad en el fondo del tubo que en la parte media del mismo.

En la primera generación se obtuvo una única banda de ADN con densidad intermedia. En la segunda generación se obtuvieron dos bandas, una con densidad ligera y otra con densidad intermedia o semihíbrida. En la tercera generación se obtuvieron dos bandas, una ligera (que ocupaba el 75%) y otra intermedia (que ocupaba el 25% restante).

 

La banda intermedia o híbrida representa una molécula de ADN que contiene una cadena pesada (parental) y otra ligera (recién sintetizada). Las cadenas ligeras representan una molécula de ADN en la que las dos cadenas han sido sintetizadas (no estaban cuando las células se pusieron en presencia de nitrógeno-15.

El hecho de que cada vez haya más cadenas ligeras y se mantenga el número de cadenas intermedias demuestra que la replicación del ADN es semiconservativa. Si fuera conservativa, aparecería siempre una banda pesada y el resto ligeras. Si fuera dispersiva sólo aparecerían bandas híbridas de densidad intermedia en todas las generaciones.

CONCLUSION:

El experimento de Meselson y Sthal concluyo en que la replicación del ADN es un proceso semiconservativo en el que cada una de las moléculas hija contiene una hebra de la molécula original y otra neoformada.

Los resultados demuestran que después de una generación, el ADN es mitad pesado (la hebra progenitora) y mitad ligero (la hebra recién sintetizada). Esto significa que el 100% de las moléculas bicatenarias son de densidad intermedia.

Después de la segunda generación, la mitad de las hebras nuevas son ligeras (con 14N-ADN del progenitor y 14N-ADN sintetizado) y la mitad son de densidad intermedia (con 15N-ADN del progenitor y 14N-ADN de nueva síntesis). Este resultado es el predicho por la replicación semiconservadora.


BIBLIOGRAFIA:
www.maph49.galeon.com/adn/experiment.html
www.ehu.es/biomoleculas/an/pdf_doc/meselson_stahl.pdf
www.mit.ocw.universia.net/7.012/f01/pdf/molebio-1.pdf