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PRACTICA : EXTRACCION Y SEPARACION DE DNA

ANTECEDENTES:

Además del agua, los carbohidratos, las proteinas y los lipidos, los seres vivos estan constituidos por otras moleculas que, aunque en menor cantidad, desempeñan funciones muy importantes. Los acidos nucleicos (DNA Y RNA) son biomoleculas solubles en agua que desempeñan funciones diversas, son moleculas complejas producidas por las celulas vivas; son esenciales para todos los organismos vivos. Estas moleculas gobiernan el desarrollo del cuerpo y sus caracteristicas especificas, ya que proporcionan la informacion hereditaria y ponen en funcionamiento la produccion de proteinas.

OBJETIVO:

Extraer el DNA y RNA de tejidos animales o vegetales e identificarlos como tales.

MATERIAL:

Tubos de centrifuga
Tubos de ensayo de 5ml
Centrifuga
Micropipetas de 1000 y 200 ul
Agua destilada esteril (20 ml para todos)
Etanol al 100% frio 20 ml
NaCl 3M
Buffer de extraccion de ADN (Urea, NaCl, EDTA, 20 ml)
Fenol/cloroformo/isopropanol frio 20 ml.
Mortero y pistilo
Higado de res
Papel aluminio
Cleenpack
Guantes

PROCEDIMIENTO:

A) Rompimiento de membranas y paredes celulares

Toma una muestra del tejido de higado (5 gr. aproximadamente) y muelelo con el mortero.

B) Digestion

Coloca tu muestra molida (1 gr aprox.) en un tubo de eppendorf de 1 ml y agregale el Buffer de extraccion (tris-HCl 0.05 M, Urea 7 M) a tempeatura de cuarto (500 ul aprox.)

Cuando hayas agregado el Buffer de extraccion a tu muestra, agitale e incubala por 10 minutos con agitacion esporádica.

A la mezcla que tienes en tu tubo de ensayo agregale 500 ul. de Fenol/Cloroformo/isopropanol frio sa guantes y no inhales los vapores.

Agita vigorosamente en Vortex, cuidando que no se tire el contenido del tubo, deja reposar a temperatura ambiente por 5 minutos.

Extrae la fase acuosa (500 ul aprox.) con una micropipeta, si no se separan las fases centrifuga a 10 000 rpm por 10 minutos y con una temperatura de 6°c.

Extrae la fase acuosa superior una vez centrifugada.

Precipitacion de acidos nucleicos DNA Y RNA

A la fase acuosa que extraes (500 ul), colócala en un tubo eppendorf limpio y agregale 400 ul. de etanol (100%) frio y 75 ul de NaCl 3 M. mezcla por inversion, suave y observa como se precipita el DNA.